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qPCR引物设计原则：

1. 引物应在核酸保守区内设计并具有特异性；

2. 引物长度一般在17-25个碱基之间，上下游引物长度不宜相差太大；

3. 引物G+C含量应在40%-60%之间，最好在45%-55%之间，引物中碱基要随机分布；

4. 引物Tm值在58-62°C之间，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超过5°C；

5. 引物3’端要避开密码子的第3位；

6. 引物的5’端可以修饰，而3’端不可以修饰；

7. 扩增产物长度在80-200 bp，最长不要超过300 bp；

8. 扩增产物不能形成二级结构。

探针设计原则：

1. 探针位置应尽可能接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；

2. 探针长度通常在25-35 bp之间，保证结合的特异性；

3. 探针的Tm值通常在65-70℃之间，比引物的Tm值高5–10℃，确保探针与模板结合的稳定性大于引物与模板结合的稳定性，GC含量在40-60%；

4. 探针5'端不应含G，因为5’端G能够淬灭荧光信号，避免报告基团的荧光在探针切割后发生淬灭。

5. 应避免连续相同的碱基出现，特别是连续GGGG；

6. 如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间；

7. 5’端荧光报告基团与3’端淬灭基团选择：

1）、选择报告基团时确认最大激发波长（Excitation wavelength，Ex）和最大发射波长（Emission wavelength，Em）与仪器是匹配的。对于多重反应，标记不同探针的报告基团的最大发射波长（Em）应该至少有15 nm的差异。

2）、对于淬灭荧光基团，必须要保证其吸收光谱与报告基团的发射光谱有重合。