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ELISA间接法操作步骤

 ELISA间接法实验原理是将抗原直接固定在固相载体上，用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量，此一级抗体的特异性非常重要。间接法操作步骤具体如下：

操作步骤：
1、抗原包被过夜（12h以上）： IgG抗原，用包被液（CBS）稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。

抗原用量：0.1μg*100N/抗原浓度 （N为板数）
2、封闭：弃上清 加300μL/孔封闭液，37℃放置2h。
3、洗涤：用洗涤液洗3次
4、加一抗(待测样品为细胞培养上清)：将含单克降抗体的细胞培养上清100μL /孔加到已包被的板上，空白培养基作为阴性对照，已知样品血清（1：200稀释于1%BSA+PBST中）作为阳性对照。37℃恒温箱温育2h。
测免疫效价待测样品为小鼠血清时：采小鼠血液于常温20min左右后放4℃至析出血清，3000r 10min离心。将含抗体的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST连续倍比稀释(按照1：200开始)，100μL /孔。每个样品平行做两份，小鼠阴性血清或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。37℃恒温箱温育2h。
5、洗涤：用洗涤液洗5次。
6、加二抗（酶标抗抗体）：羊抗鼠IgG-HRP，用1%BSA+PBST l ：10000稀释，100μL／孔， 37℃恒温箱温育1h。
7、洗涤：用洗涤液洗5次，
8、显色：加新鲜配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔，37℃恒温箱放置10min，显示蓝色。
9、终止反应、比色：加30μL/孔H2SO4终止液．颜色变黄；用酶标仪测定450nm 630nm处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。