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注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定原理：

AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。

3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。

AchE活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

组织AchE活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（Cpr ×V样）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（W ×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷W

细菌、细胞AchE活性

活性单位定义：每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷细胞数量

血清AchE活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷V样÷T

=245×△A

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10^-4L；V样总：提取液体积，1 mL；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

1. 组织AchE活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（Cpr ×V样）÷T

= 490×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（W ×V样÷V样总）÷T

= 490×△A÷W

2. 细菌、细胞AchE活性

活性单位定义：每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 490×△A÷细胞数量

3. 血清AchE活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷V样÷T

=490×△A

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10^-4L；V样总：提取液体积，1 mL；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。

测定意义：

AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。