ELISA实验的洗涤步骤优化策略
ELISA中的洗涤虽非反应步骤，却直接决定实验成败。其作用是清除未结合的抗体/抗原及非特异性吸附的干扰物，仅保留特异性的抗原-抗体复合物。聚苯乙烯板对蛋白质有普遍吸附性，因此有效的洗涤至关重要。以下是一些具体的优化方法：
一、洗涤参数设置
洗涤量和次数是影响效果的核心变量。
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参数 |
推荐值/范围 |
说明 |
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洗涤量 |
300–350 μL/孔 |
应略高于包被体积（通常200 μL），确保孔壁完全覆盖。部分文献建议使用350 μL 。 |
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洗涤次数 |
3–5次 |
一般3–4次即可，高背景时可增至4–5次；洗板机因残留多，建议至少4次以避免假阳性。 |
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浸泡时间 |
1–2分钟 |
静置浸泡有助于松动非特异结合物，手工洗板推荐此时间。 |
手工操作时，每次加液后应静置1–2分钟再甩干，重复3–5次。
使用洗板机时，需校准吸液高度，避免残留过多或吸头压底导致效率下降。
二、洗涤液选择与优化
通常使用PBST作为洗涤液，其中包含0.05%到0.2%的非离子型洗涤剂，如吐温20，过高浓度的洗涤剂可能导致抗原或抗体解吸附，影响实验灵敏度。
操作规范：
手工洗板：加入洗液时要确保每孔刚满，避免孔间液体交叉。洗涤结束后，用吸水纸轻轻拍干，拍干时垂直，避免交叉感染，且拍干要彻底。
洗板机洗板：使用洗板机时，确保洗涤头通畅，每次洗板后不能拍干，可能需要增加洗板次数来减少误差。洗板机洗板次数通常为4-5次，过多或过少都会影响结果。
三、洗板机的使用
尽管手工洗板人为因素较大，但洗板机可以提供更快、更一致的洗涤，减少人为误差。在使用洗板机时，应检查其工作状态，确保每次洗涤均匀且彻底。
四、其他注意事项
洗涤过程中保持操作台清洁，避免灰尘或杂质落入孔中。
确保所有反应孔的洗涤条件（量、次数、时间）一致，以减少孔间差异。
通过合理设定洗涤量（300–350 μL）、次数（3–5次），使用含0.05%–0.2%吐温20的PBS缓冲液，并结合设备优化与规范操作，可显著提升 ELISA实验的准确性与重复性。尤其对于高背景或低信号问题，应优先从洗涤环节排查。
