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重组蛋白的制备流程分析

 重组蛋白是通过基因工程技术将编码目标蛋白的基因导入宿主细胞（如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等），利用宿主细胞的转录翻译机制合成并纯化得到的蛋白质。其制备流程可分为目标基因获取、重组载体构建、宿主转化、诱导表达、细胞破碎、纯化复性及质量控制等关键步骤，以下是相关内容详细说明：

一、目标基因获取

目标基因是重组蛋白的“蓝图”，需根据蛋白功能或序列设计获取。常见方法包括：

1、PCR扩增：以天然或合成的基因为模板，设计特异性引物，通过PCR扩增得到目标基因片段；

2、基因合成：对于难以从天然来源获取的基因（如人源胶原蛋白、修饰后的突变基因），可通过化学合成获得；

3、RT-PCR：从细胞或组织中提取RNA，反转录为cDNA后扩增目标基因（适用于真核生物基因）。

二、重组表达载体构建

将目标基因插入表达载体（如质粒、病毒载体），并添加调控元件（启动子、终止子）和纯化标签（便于后续分离）。常见载体及元件包括：

1、载体选择：原核系统常用pET系列、pUC系列；真核系统常用巴氏毕赤酵母载体、哺乳动物细胞病毒载体；

2、调控元件：启动子（如原核的T7启动子、真核的CMV/EF1α启动子）、终止子（如TAA）；

3、纯化标签：6×His（最常用，结合金属螯合层析）、GST（谷胱甘肽转移酶，提高 solubility）、FLAG（短肽标签，便于 Western blot 检测）。

三、转化/转染宿主细胞

将重组载体导入宿主细胞，使其成为“蛋白工厂”。宿主选择需根据蛋白特性（如是否需要翻译后修饰）：

1、原核宿主：大肠杆菌（E.coli ），优点是生长快、成本低，适合大量表达简单蛋白；

2、真核宿主：酵母（如巴氏毕赤酵母 ）、哺乳动物细胞（如HEK293、CHO ），优点是能进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰，适合表达复杂蛋白（如人源胶原蛋白、抗体）；

3、植物宿主：如药用水稻，通过水稻胚乳细胞表达人血清白蛋白，成本低、无动物源性污染。

方法：原核系统用热激转化（大肠杆菌）；真核系统用脂质体转染、慢病毒感染或电转化（酵母）。

四、诱导表达

通过诱导剂激活启动子，驱动目标基因转录翻译。常见诱导剂及条件：

1、原核系统：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），诱导T7启动子表达；

2、真核系统：甲醇（诱导巴氏毕赤酵母的AOX1启动子 ）、四环素（诱导哺乳动物细胞的Tet-on系统）；

3、植物系统：水稻种子成熟过程中自然表达。

五、细胞破碎与粗提

收集诱导后的细胞/菌体，通过物理或化学方法破碎细胞，释放胞内蛋白：

1、物理方法：超声破碎（最常用，如16 中超声破碎大肠杆菌，收获重组蛋白）、高压均质；

2、化学方法：溶菌酶（裂解细菌细胞壁）、去污剂（如Triton X-100，裂解真核细胞膜）；

3、分泌型蛋白：若蛋白分泌至培养液（如酵母、哺乳动物细胞），可直接收集上清。

六、纯化与复性

通过层析技术分离目标蛋白，去除杂质（如杂蛋白、核酸、内毒素）。常见方法：

1、亲和层析：利用标签与配体的特异性结合（如6×His标签结合Ni²+柱、GST标签结合谷胱甘肽柱），是重组蛋白纯化的核心步骤；

2、凝胶过滤层析：根据分子大小分离，去除 aggregates 或小分子杂质；

3、离子交换层析：根据蛋白电荷差异分离，进一步提高纯度；

3、复性：若蛋白形成包涵体（原核系统常见），需用变性剂（如尿素、胍盐酸）溶解后，通过透析、稀释等方法恢复天然构象。

七、质量控制与功能鉴定

确保重组蛋白的纯度、活性、结构符合要求，常见检测方法：

1、纯度检测：SDS-PAGE（检测分子量）、HPLC（定量纯度）；

2、活性鉴定：功能试验、酶活测定（如氧化还原酶的催化活性）；

3、结构鉴定：质谱（MS）、圆二色谱（CD）（检测二级结构）。

不同宿主系统的特点对比

总结：

重组蛋白制备的核心逻辑是“基因→载体→宿主→表达→纯化”，每一步需根据目标蛋白的特性（如大小、修饰需求、活性）优化。随着技术发展，植物生物反应器、无细胞翻译系统等新型方法正在逐步应用，为重组蛋白的规模化生产提供了更多选择。