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影响ELISA实验的特异性的因素有哪些？

 ELISA实验的特异性主要受以下因素影响，这些因素可能导致假阳性或假阴性结果：

一、样本相关因素

1、‌内源性干扰物质

类风湿因子（RF）可与抗体Fc段结合，导致假阳性。

补体系统激活可能封闭抗原表位或交联抗体，引发假阳性/阴性。

溶血样本中的血红蛋白含过氧化物酶活性，催化底物显色产生假阳性。

细菌污染可能引入内源性辣根过氧化物酶，干扰显色反应。

2、‌样本保存条件

反复冻融或长期保存导致蛋白降解，影响检测准确性。

二、试剂与操作因素

1、‌抗体特异性

抗体交叉反应或浓度过高会增加非特异性结合。

建议使用单克隆抗体或优化抗体稀释比例。

2、‌洗涤不充分

未结合物质残留会提高背景信号，需延长洗涤时间并添加Tween-20等表面活性剂。

3、‌封闭效率

封闭液浓度不足或时间过短会导致非特异性吸附，建议优化封闭剂（如BSA、明胶）。

三、抗体相关因素

1、‌抗体质量与交叉反应‌

低特异性抗体易与非目标抗原结合，导致假阳性。建议选用高纯度单克隆抗体，并通过预实验验证其交叉反应性。

2、抗体浓度失衡‌

抗体浓度过高（如>10 μg/mL）可能引发非特异性结合，需通过棋盘滴定法确定最佳工作浓度。

四、优化策略

‌交叉验证‌：采用竞争ELISA或SPR技术验证抗体特异性。

‌温度控制‌：严格维持37℃孵育环境，避免温度波动导致非特异性结合。

通过上述措施可显著提升ELISA的特异性，降低假阳性风险。