蛋白浓度测定方法步骤
蛋白定量的方法有很多种，应用较多的主要有两种：BCA蛋白定量检测法和Bradford蛋白定量检测法，市售的蛋白定量试剂盒也多基于上述两种检测方法而开发的。两种方法均需配制蛋白标准品，蛋白与定量试剂经过一定时间的反应（BCA法反应为37℃、20-30min，Bradford法反应一般为37℃，5min），酶标仪读取样品的OD值，绘制的蛋白标准曲线，依据标准曲线计算WB蛋白的浓度。
蛋白定量:
取适量上述步骤中未变性的总蛋白溶液，用BCA 蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T；G2026-1000T）测蛋白浓度，蛋白浓度测定方法如下：
1、配制蛋白标准贮备液
取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。
2、配制蛋白标准工作液
取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。
3、绘制标准曲线（酶标仪法）
将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线。
4、准备待测样品
将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。
5、配制BCA显色工作液
将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。
6、检测
向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL，充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s），37℃反应30 min后，以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。（注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应）
G.计算
以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。
提示：
1. BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。
2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。
3. 为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液，同保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。
4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。
