实时荧光定量PCR引物和探针储存依据
目前所有的探针法qPCR的理论基础都是利用了荧光共振能量转移现象,探针上存在一对能产生荧光共振能量转移的基团,利用PCR反应中的一些过程(酶切,杂交等),使两个基团的距离产生变化,使系统中的荧光强度或者荧光种类发生变化,这种变化又与PCR产物的种类和量有直接关系,通过检测这种变化,我们就可以检测出PCR反应体系中产物的种类和量。探针法来说,反应管中的荧光强度也是检测PCR产物量的依据。
1、引物和探针的储存
尽管引物和探针的储存经常被忽略,但其在保证实时荧光定量 PCR 分析的长期成功和一致性方面具有重要作用。影响引物和探针的稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否被长时间暴光、的引物和探针的浓度以及储存溶液的组分。图3扩增曲线分别显示了储存不当的引物 (A) 与储存适当的引物 (B) 产生的效果。
2、长期保持引物和探针的稳定性的关键有四点:
(1)、低压冻干的引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。引物一旦重新溶解,即应置于 -20°C 保存,且若保存时间超过一年则应对其进行监测,看它是否出现功能下降。
(2)、对于标记的引物和探针,则应采取措施避免标记物暴光 (例如使用不透明管及置于暗处保存),以延长它们的使用寿命。
(3)、引物浓度也可影响其稳定性。建议引物的储存浓度不低于10 μM;实际上,在大多数情况下,100 μM 的引物浓度操作更简单。引物和探针还应分装保存,以减少冻融次数,特别是标记的引物和探针。
(4)、最后,TE 缓冲液可形成比水更为稳定的环境。此外,含有 0.1 mM EDTA的 TE 缓冲液 (标准 TE 中含有 1 mM EDTA) 是一种理想的溶液,这是由于一些 PCR 反应对 EDTA 的灵敏度可能有一些残存。