谷氨酰胺合成酶(GS)试剂盒试验GS活力单位的计算
测定意义:
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)(EC 6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。
测定原理:
GS在ATP和Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下与铁形成的络合物在540nm处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。
注:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
GS活力单位的计算:
一.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y = 0.8348x + 0.0008,R2 = 0.9999
1、血清(浆)GS活性
单位定义:每mL血清(浆)在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
计算公式:
GS(μmol/h/mL)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷V样÷T
=10.268×ΔA
2、组织、细菌或细胞GS活性
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/mg prot)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷(Cpr×V样)÷T
=10.268×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/g 鲜重)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T
=10.268×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h//104 cell)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.021×ΔA
V反总:反应体系总体积,0.3mL; V样:加入样本体积,0.07mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
二.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y = 0.4174x + 0.0008,R2 = 0.9999
1、血清(浆)GS活性
单位定义:每mL血清(浆)在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
计算公式:
GS(μmol/h/mL)=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷V样÷T
=20.535×ΔA
2、组织、细菌或细胞GS活性
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/mg prot)=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷(Cpr×V样)÷T
=20.535×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/g 鲜重)=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T
=20.535×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每小时产生1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。
GS(μmol/h/104 cell)=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.041×ΔA
V反总:反应体系总体积,0.3mL; V样:加入样本体积,0.07mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。


