ELISA试验检测通用操作步骤
ELISA检测是一种免疫检测方法，通常用于测量生物样品中的抗体或抗原，包括蛋白质或糖蛋白。像其他免疫检测法一样，它们依靠抗体与目标的结合来促进检测。
通常情况下，ELISA检测是在96孔板中进行的，这种形式使其适合于一次筛选许多样品。血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液和尿液都是用于这些检测的常见样品类型，但理论上大多数液体样品类型都可以使用。然而，重要的是要考虑到一些样品类型可能包括抑制性因素，如共享相似抗原表位的缓冲液成分或可能损害目标或检测成分的蛋白酶等因素，这些因素可能干扰检测的性能。
有几种不同的检测形式，但都依赖于目标本身或能够捕获目标的抗体/抗原与包被板表面的结合。然后采用测定步骤，包括结合抗原，或更常见的抗体，以使成功的结合被测定和量化，最常见的是通过比色测定。现在有四种主要的ELISA类型，直接法、间接法、夹心法和竞争法。虽然不同类型的ELISA方案有差异，但大多数检测都有的通用过程：
1、板包被
大多数ELISA检测第一步是将检测的第一个成分与包被板结合。这通常是通过被动吸附完成的，一个非特异性的过程，所以结果将取决于涂在包被板上的东西。
如果使用了含有抗原的样品，那就需要一个具有选择性的包被板，因为各种抗原都会结合，而不仅仅是那些感兴趣的。然而，如果像用于抗体检测的ELISA间接法那样使用纯化抗原，或像ELISA夹心法那样使用捕获抗体，那么我们已经准备了一个具有选择性的包被板。
包被板的类型大多数是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，其具有不同的结合特性，这取决于目标物质和检测的性质。一些目标物质，包括重度糖基化的蛋白质、碳水化合物、DNA、脂类、短肽和有洗涤剂的蛋白质，是不能很好吸附的。在这些情况下，建议使用经过处理允许共价连接到表面的包被板。
2、孵育
将试剂加入ELISA板后，必须进行孵育，以便有时间进行结合或反应。每次孵育的温度和时间将取决于检测步骤和正在进行的操作。通常在样品应用之后，与37℃下孵育1小时。
然而，像阻断这样的步骤可以在冰箱中过夜，测定过程中的孵育通常在室温下进行，时间短得多。
3、洗涤
洗板是在应用在检测每个组成部分之间，直到结果测定的一个重要步骤。溶液从孔中排空后，通常使用磷酸盐缓冲盐水-20（PBST）做为缓冲液清洗孔，以去除任何残留的未结合抗原、抗体或试剂。
这可以用多通道移液器手工完成，或使用自动洗板机。
不充分的清洗可能会导致高背景信号，而过多的清洗会导致样品信号低。不一致的清洗可能会导致整个板块的不一致，从而导致不可靠的结果。
4、阻断
在用蛋白质包被ELISA板后，阻断通常是必要的，以防止在接下来方案步骤中测定抗体的任何非特异性结合。
与检测无关的混合蛋白被添加到板中并进行孵育，占据任何可用的非特异性结合位点。常见的蛋白质阻断缓冲液选择包括脱脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。
另外，非离子洗涤剂，如Tween 20或Triton X-100，可作为阻断剂使用，但不能像蛋白质那样提供永jiu性阻断。无效的板块阻断会导致背景噪音增加，降低检测的灵敏度和特异性。
5、抗体
实验性抗体是大多数ELISAs的基石，选择正确的抗体至关重要，特别是在使用多种抗体的情况下。单克隆抗体和多克隆抗体都可以使用，它们都有各自的有点和缺点。单克隆抗体提供高特异性，但成本较高。另一方面，多克隆抗体可以在多个结合点与目标结合，放大信号并提高灵敏度。
使用采用二级抗体的方法增加了额外的步骤，延长了检测时间，增加了出错机会，需要更多优化来找到合适的兼容抗体对。然而，使用多克隆二级抗体所带来的灵敏度提高可能使其成为一种值得或必须的有效检测方法发展方向。
6、测定
无论使用哪种ELISA类型，最后一步都是测定步骤，最常见的是利用酶介导的可见颜色变化化学反应，然后可以用紫外-可见分光光度法测量。
酶结合抗原或抗体被应用到测试孔中，如果目标存在，它就会与之结合。当酶的适当底物被添加到包被板上时，它会引起颜色变化，与孔内结合的目标物的数量成正比。辣根过氧化物酶（HRP）是一种常用共轭物，一般与底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）合作使用。底物在HRP的作用下变成蓝色，然后在加入硫酸溶液后变成黄色，停止反应。
然后可以用酶标仪（在TMB加入终止液后，在450nm波段测定），这是一种紫外可见分光光度计，来确定每个孔的吸光度值，并根据检测设计进行校正和计算，如减去空白孔平均值、技术重复平均值或与标准比率计算。
