ELISA实验操作规范
ELISA实验操作人员经常会遇到自己的检测数据和相关文献中的实验结果差别较大,甚至相反,或与预期不一致的情况,也常常为此感到困惑。针对此现象现给您答疑解惑,引起ELISA测定结果与文献报导不一致的原因主要有三点:标本因素、试剂因素、操作因素。
现就操作因素做详细说明:
1、严格按照试剂说明书进行操作。
2、检测前应将试剂放置室温平衡半小时,洗涤液应现用现配,同时观察浓缩洗涤液中有无结晶,若有结晶应放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB时应注意有无颜色变化,若已显色则可能过期或变质,也不可使用。
3、加样后及时放入孵育箱。标本较多时,要分批操作。按照说明书步骤严格控制操作时间,防止孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。
4、封板温育时,各孔一定要封严,防止阳性标本的液体蒸发,不会引起孔间的污染,产生周边现象从而导致“花板“的出现。
5、应保证酶标版清洁,整个操作过程中保证酶标版不接触次氯酸。
6、加酶试剂后用吸水纸在酶标版表面轻拭吸干。
7、合理安排检测量,以免反应板过多造成洗板等待时间长。
8、用洗板机洗板时,保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完版后好在吸水纸(选择干净,无尘的吸水材料)上轻轻拍干。若血清中的纤维蛋白或洗涤液中有结晶,将堵塞洗板机针孔,造成全堵或半堵状态,以致使未结合的酶标记物不能完全洗脱,而使后底物显色时加深,造成假阳性或花板。废液瓶装满后应及时清空,以防止废液回流对管道的污染,而使洗涤不彻底,造成花板。洗板结束后应用蒸馏水彻底清洗管道,以防止废液在管道中的残留。洗涤次数及加液量不可完全按照试剂说明书设定,应根据本实验室的实际情况来设定,开展新项目前,应做好验证工作,根据洗涤的效果来决定洗涤的次数和加液量。同时应根据仪器维护保养程序,定期对洗板机进行维护保养。
9、手动洗板时,加洗液要快速,没有多道移液器可以使用洗瓶。洗液应新鲜配制,以免被其他试剂污染,或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水纸上拍板,选用无粉尘和碎屑的优质吸水纸。需要用力拍板,使孔内没有可见液体挂壁;但也不能太重,不能让样品干太久。酶标板拍干后立即做后续的加液。
10、加样量的准确与否,直接影响抗原抗体结合物的浓度,直至后显色的深浅。吸嘴插入血清不可太深,若插入太深,吸嘴外壁可能粘连太多血清,轻微的抖动动即可将吸咀外壁的血清溅入其它包被孔中,造成交叉污染。加样时应尽可能的垂直加样,并加在包被孔的底部,不可加在孔的上部。标本量大时,可考虑使用排枪加试剂,可提高速度,但使用排枪时应注意吸嘴一定要装好,不可松动,否则会影响加样量的准确度。加样时保持显色剂不外流,显色剂应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。
11、加样时间间隔对结果也有一定的影响,在竞争抑制法试验中,理论上应该是标本与酶标抗体混合后同时加入反应孔,若标本先于酶标抗体加入反应孔,则标本会先与包被抗体进行反应,造成特异性假阳性。若是有干扰物质存在时表现明显,在公平条件下,干扰物质与包被抗体的结合能力会低于标本,而在非公平条件下,干扰物质会优先与包被抗体进行结合,出现假阳性。做HBcAb项目时,若标本与酶加样时间间隔太长,会引起吸光度的趋势性变化,会造成吸光度的降低。特别是针对临界值标本,出现假阳性。
12、洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液,各种试剂盒的洗液不要混用。洗液需要稀释时,应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的超纯水或双蒸水,电导率小于1.5μS/cm,洗液如果结晶应待其溶解后配制。配制后要测定其pH值,使其范围在7.2-7.4之间。