PCR实验出现假阳性特别应注意操作
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR),是用DNA聚合酶在体外对特定的DNA片段进行快速扩增的方法。该方法特异性高、敏感性强、操作简单、快速,不通过活细胞,在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10~109倍,现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。
PCR实验出现假阳性特别警示以下操作:
PCR只需几个DNA分子做模板就可大量扩增,应注意防止反应体系被少量DNA模板污染和交叉污染,这是造成假阳性最大的可能。
1. 使用PCR室前认真洗净手,操作应戴手套并勤于更换。
2. 成套试剂,小量分装,专一保存,防止他用。配制试剂用新器具,用后做一次性处理。
3. 使用完后切记开紫外15~30min,尤其是配液室;试验完毕要收拾台面,这一点对PCR试验来说尤其重要,因为试验垃圾可能是其他人的污染源,即使不是,未弃的垃圾易成为空气中可能存在的DNA气溶胶的载体,而造成污染。
4. 试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器的机会。
5. 加入模板切忌喷雾污染,在吸取液体时,尽量避免用力过快吸取。避免反应成分或模板喷到移液器上,污染移液器和环境。所有非即用管都应盖严,加模板DNA后应更换手套。
6. 准确吸取各反应成分,配反应液时要尽量避免1~2μl量加入,避免配单个20μl反应体系。浓度高的液体在应用之前稀释至适当浓度,然后再加入反应体系中。做多管PCR反应时首先将除模板之外的其他成分混合一起,然后再分成单个PCR反应管中,这样,加入各成分的量比较准确。
7. 电泳时注意事项电泳上样时,避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。特别要注意EB为强致癌物质,必须戴手套,谨慎操作,摇动时不要外溅。